|
• Тюнинг танк подробности на сайте. |
Врачи рассказывают, как распознать ВИЧ-инфекцию
Основные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции включают выявление антител к вирусу, вирусных антигенов и выделение вируса в культуре клеток.Антитела к вирусу появляются в сыворотке большинства ВИЧ-инфицированных через 4-8 недель после заражения. Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции служит определение антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Этот метод очень надежен, его чувствительность составляет более 99,5%.
В большинстве диагностических лабораторий для проведения этого анализа используются коммерческие наборы, позволяющие определять антитела как к ВИЧ-1 , так и к ВИЧ-2 , поскольку в состав наборов входят естественные или рекомбинатные антигены ВИЧ обоих типов.
Набор антигенов в этих наборах постоянно обновляется, что позволяет повысить их чувствительность при определении антител к новым штампам ВИЧ, например штампам группы О. Результаты расценивают как положительные, отрицательные или сомнительные. Однако специфичность этого метода мала.
Так, при обследовании лиц из групп низкого риска ВИЧ-инфекции (например, доноров крови) оказалось, что лишь 13% людей с положительными результатами ИФА были действительно инфицированы ВИЧ. Причинами ложноположительного результата могут быть наличие в сыворотке антител HIA класса ¦¦ и другим аутоантигенам, болезни печени или недавняя вакцинация против гриппа. Таким образом, все случаи положительного или сомнительного результатов ИФА должны быть проверены с помощью более специфичных методов.
Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции чаще используют иммуноблоттинг. Поскольку этот метод позволяет разделить антигены по молекулярной массе, то удается одновременно обнаружить антитела к нескольким антигенам ВИЧ. О наличии антител к определенному антигену судят по появлению окрашенной полосы на участке мембраны, где локализован данный антиген.
При отрицательном результате иммуноблоттинга (отсутствии окрашенных полос) положительные и отрицательные результаты ИФА расцениваются как ложноположительные. Если на мембране обнаруживают три полосы, соответствующие продуктам разных генов (gag, pol и env), то результат иммуноблоттинга - заведомо положительный.
Однако в большинстве лабораторий результаты иммуноблоттинга оценивают в соответствии с критериями, принятыми Ассоциацией руководителей медицинских лабораторий США и Центром по контролю заболеваемости: результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ - p24 , gp41 и gp120 (или gp160).
Положительный результат иммуноблоттинга подтверждает диагноз ВИЧ-инфекции. Если результат иммуноблоттинга нельзя расценить как положительный или отрицательный, его считают сомнительным. Наиболее вероятна причина сомнительного результата - наличие в сыворотке здорового человека антигенов, перекрестно реагирующих с антителами к каким-либо антигенам ВИЧ, чаще всего с антителами к p24 и p55. Сомнительный результат иммуноблоттинга может быть получен и при обследовании ВИЧ-инфицированных, у которых гуморальный иммунный ответ на вирус находится на ранней стадии развития. В связи с этим при получении сомнительных результатов иммуноблоттинга его обязательно повторяют через месяц.
Для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции можно использовать также ловушечный ИФА на антиген р24 и методы выявления вирусной РНК. Иммуноблоттинг прекрасно подходит для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции, но не годится как предварительный метод диагностики: у 20-30% лиц с отрицательными результатами ИФА и ПЦР при иммуноблоттинге обнаруживается как минимум одна окрашенная полоса. Обычно эти полосы окрашены слабо.
Они образуются в результате перекрестных реакций с антителами, не связанными с ВИЧ. Тем не менее при получении таких результатов иммуноблоттинга необходимы дальнейшие исследования (ПЦР для выявления вирусной РНК или ДНК, метод разветвленной ДНК или ловушечный ИФА на антиген р24), поскольку они позволяют подтвердить диагноз ВИЧ-инфекции на самых ранних стадиях.
Диагностический алгоритм при подозрении на ВИЧ-инфекцию
В первую очередь проводят ИФА.
Если результат исследования отрицателен и отсутствуют указания на возможность недавнего заражения (в течении 3 месяцев перед обследованием), диагноз ВИЧ-инфекции исключают. Исследования повторяют при подозрении на недавнее заражение, а также при положительном (или сомнительном) результате первого исследования. В последнем случае отрицательный результат двух последовательных исследований исключает диагноз ВИЧ-инфекции и свидетельствует о технических ошибках, допущенных при первом исследовании.
Если результаты повторных ИФА положительны или сомнительны, проводят иммуноблоттинг. Положительный результат иммуноблотинга служит подтверждением диагноза ВИЧ-инфекции. При отрицательном результате иммуноблоттинга результаты ИФА считают ложноположительными и исключают диагноз ВИЧ-инфекции. Если результат иммуноблоттинга сомнителен, то приблизительно через месяц это исследование повторяют. Кроме того, дополнительно можно провести исследования с помощью ловушечного ИФА на антиген р24 или ПЦР для определения вирусной ДНК или РНК.
Если результаты дополнительных исследований отрицательны, а окраска полос при повторном иммуноблотинге не претерпела изменений, то диагноз ВИЧ-инфекции исключают. При усилении окраски полос или положительном результате хотя бы одного из дополнительных исследований ставят предположительный диагноз ВИЧ-инфекции и иммуноблоттинг проводят повторно через несколько месяцев. Положительный результат иммуноблоттинга подтверждает диагноз.
Методы прямого выявления ВИЧ и его компонентов
Наиболее простой из них - ловушечный ИФА на антиген р24. Это модификация ИФА, при которой антитела к вирусному белку р24 иммобилизируют на твердой подложке. При добавлении сыворотки больного происходит сорбция антигена (белка р24) на этих антителах. Свободные белок р24 находится приблизительно у 30% ВИЧ-инфицированных. Однако в крови белок р24 находится не только в свободной форме, но и в виде иммунных комплексов, поэтому обработка проб слабой кислотой с
целью расщепления иммунных комплексов увеличивает этот показатель до 50%. В течении нескольких недель после заражения, до развития гуморального иммунного ответа на ВИЧ, концентрация белка р24 в сыворотке ВИЧ-инфицированных резко возрастает. При появлении в крови антител к белку р24 концентрация этого антитела снижается. На поздних стадиях ВИЧ-инфекции, сопровождающихся выраженной виремией, концентрация белка р24 (особенно в составе иммунных комплексов) в сыворотке вновь возрастает.
Патогенетическая роль свободного белка р24 неизвестна, однако показано, что при его наличии в сыворотке во время бессимптомной фазы риск развития СПИДа в течение следующих 3 лет в среднем в три раза выше, чем в отсутствие этого антигена, несмотря на примерно на примерно одинаковое исходное число лимфоцитов CD4 у всех больных.
Кроме того, в ходе клинических испытаний установлено, что антиретровирусное лечение приводит к снижению концентрации белка р24 в сыворотке ВИЧ-инфицированных. Однако целесообразность определения этого антигена для оценки эффективности антиретровирусного лечения не доказана - существуют гораздо более чувствительные методы ПЦР и разветвленной ДНК.
В настоящее время ловушечный ИФА на антиген р24 с успехом применяется для диагностики ВИЧ-инфекции во время острой лихорадочной фазы, когда концентрация этого антигена высока, а антител к белкам ВИЧ, наоборот, низка. кроме того. в США этот метод используется вместе с ИФА для проверки донорской крови на ВИЧ.
Методы, основанные на ПЦР
Данные методы получили широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний. Благодаря применению этих методов удалось достичь значительного прогресса в понимании патогенеза ВИЧ-инфекции. Несмотря на то, что высокая чувствительность ПЦР часто служит причиной ложноположительных результатов, в настоящее время эти методы признаны эталонными для диагностики ВИЧ-инфекции, особенно у новорожденных из группы риска.
Существуют два основных метода, позволяющие выявить соответственно провирусную ДНК и вирусную РНК.
Первый метод заключается в следующем: 1) из предварительно лизированных лимфоцитов и моноцитов крови выделяют ДНК; 2) с помощью специально подобранных праймеров амплифицируют (синтезируют множество копий) консервативный участок провирусной ДНК, причем чаще всего используют пары праймеров, комплементарные последовательностям данных концевых повторов и гена gag; 3) полученные копии выявляют с помощью гибридизационного анализа.
Положительные и отрицательные контроли позволяют исключить ошибочные результаты ПЦР, обусловленные загрязнением исследуемой пробы и нарушением процесса амплификации ДНК.
Метод позволяет обнаружить одну противовирусную ДНК на 10000 - 100000 клеток и используется для диагностики ВИЧ-инфекции (особенно в первые 1 - 3 месяца после заражения, пока антитела к ВИЧ отсутствуют), а также для анализа нуклеотидных последовательностей противовирусной ДНК и выявления штампов ВИЧ, устойчивых к антиретровирусым средствам.
Второй метод заключается в следующем: 1) выделяют всю РНК, присутствующую
в исследуемой сыворотке; 2) с помощью обратной транскриптазы получают смесь разных кДНК; 3) проводят ПЦР, добавляя к этой смеси праймеры, комплементарные участкам вирусной к ДНК; 4) полученные копии выявляют с помощью гибридизационного анализа. Метод используют как для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, так и для измерения концентрации вирусной РНК в сыворотке.
Лабораторные методы, основанные на ПЦР, используют при положительных (или сомнительных) результатах ИФА и сомнительных результатах иммуноблоттинга, а также в тех случаях, когда серологическое исследование нецелеобразно (например, при диагностике ВИЧ-инфекции у больных с гипогаммаглобулинемией).
Однако из-за высокой стоимости и большого количества ложноположительных результатов, обусловленных загрязнением исследуемых проб, эти методы применяют лишь в тех случаях, когда стандартное серологическое исследование не позволяет с уверенностью поставить или исключить диагноз ВИЧ-инфекции.